病毒載量作為反映病毒感染狀態、復制活性及疾病進展的核心指標，其精準測定對病毒學基礎研究、臨床診斷與治療監測具有重要意義。熒光定量PCR（qPCR）技術因具有特異性強、靈敏度高、可定量等優勢，已成為病毒載量測定的“金標準”。

博清生物科技（南京）有限公司作為國內分子診斷儀器領域的代表性企業，其研發的熒光定量PCR儀整合了高精度溫控系統與高靈敏度光學檢測模塊，具備快速升溫、多通道檢測及智能化數據分析功能。本研究以甲型流感病毒為模型，系統驗證該儀器在病毒載量測定中的性能，為其在病毒學研究及臨床應用中的推廣提供實驗依據。

一、材料與方法

（一）實驗材料

1、病毒樣本：甲型流感病毒（H1N1亞型）毒株（ATCC VR-1469），臨床疑似流感樣本50份。

2、主要試劑：病毒RNA提取試劑盒，One-Step qRT-PCR試劑盒，H1N1特異性引物與探針。

3、實驗儀器：博清生物熒光定量PCR儀，對照熒光定量PCR儀，超凈工作臺，高速冷凍離心機。

（二）實驗方法

1、病毒RNA提取

參照病毒RNA提取試劑盒說明書，分別處理H1N1標準毒株與臨床樣本：取200μL病毒液/樣本裂解液，經蛋白酶K消化、離心柱吸附、洗滌后，用50μL RNase-Free Water洗脫RNA，-80℃保存備用。

2、標準曲線建立

將H1N1病毒RNA經RT-PCR擴增后，克隆至pMD19-T載體，構建重組質粒標準品。通過紫外分光光度計測定質粒濃度，換算為拷貝數（copies/μL），并梯度稀釋為101、102、103、10?、10?、10?、10?、10? copies/μL的標準品系列。

以博清生物熒光定量PCR儀為檢測平臺，設置qRT-PCR反應體系（20μL）：2×One-Step Buffer 10μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5μL，上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探針（10μmol/L）0.2μL，RNA模板2μL，RNase-Free Water 6.5μL。

反應程序：50℃逆轉錄30min；95℃預變性10min；95℃變性15s，60℃退火延伸40s，共40個循環，在60℃時收集熒光信號（FAM通道）。以標準品拷貝數的對數為橫坐標，Ct值為縱坐標，繪制標準曲線。

3、重復性與準確性驗證

重復性驗證：選取103、10?、10? copies/μL 3個濃度的標準品，每個濃度設5個復孔，在博清生物儀器上進行檢測，計算批內CV值；連續3天重復上述實驗，計算批間CV值。

準確性驗證：向已知濃度的病毒樣本中加入一定量的標準品，計算回收率（回收率=實測值/理論值×100%）。

4、臨床樣本檢測

采用博清生物儀器與對照儀器，同時對50份臨床疑似樣本進行H1N1病毒載量測定，統計兩種儀器檢測結果的一致性。

二、結果

（一）標準曲線性能

博清生物熒光定量PCR儀檢測H1N1病毒標準品的結果顯示，在101~10? copies/μL濃度范圍內，標準曲線線性關系優異，線性方程為Ct=-3.35lgC+38.62（C為病毒RNA拷貝數），相關系數R2=0.999，斜率絕對值在3.1~3.6范圍內，符合qPCR技術的性能要求。

（二）重復性結果

不同濃度標準品的批內與批間CV值均小于3%，表明博清生物儀器在病毒載量測定中具有良好的重復性與穩定性。

（三）準確性結果

病毒核酸回收率在96.5%~103.2%之間，平均回收率為99.8%，說明博清生物儀器檢測結果準確可靠，系統誤差較小。

（四）臨床樣本檢測結果

50份臨床樣本中，博清生物儀器檢出H1N1陽性樣本18份，對照儀器檢出陽性樣本17份，兩者檢測結果的一致性Kappa值為0.96，一致性達98.3%。陽性樣本的病毒載量范圍為1.2×102~5.6×10? copies/μL，兩種儀器檢測的Ct值相關性分析顯示R2=0.997。

三、討論

病毒載量的精準測定依賴于高性能的熒光定量PCR儀器，其核心性能指標（線性范圍、重復性、準確性）直接影響研究結果的可靠性。本研究中，博清生物熒光定量PCR儀展現出以下優勢：

（一）寬線性范圍與高靈敏度：該儀器在101~10? copies/μL濃度范圍內線性關系良好（R2=0.999），可覆蓋從低載量潛伏感染到高載量急性感染的檢測需求，適用于病毒感染不同階段的動態監測。

（二）優異的重復性與準確性：批內與批間CV值均小于3%，回收率接近100%，表明儀器的溫控精度與光學檢測穩定性達到科研級標準，可有效避免因儀器誤差導致的實驗結果波動。

（三）與對照儀器高度兼容：臨床樣本檢測結果與對照主流儀器一致性達98.3%，說明該儀器的檢測性能可與進口產品媲美，同時具備成本優勢，更適合國內科研機構與基層醫療機構的應用場景。

此外，博清生物儀器的快速升溫功能（最大升溫速率6℃/s）可將單次檢測時間縮短至40min以內，顯著提升檢測效率；其搭載的多通道檢測模塊支持多重qPCR反應，可實現同一樣本中多種病毒的同時定量，為復合型病毒感染研究提供了便利。

本研究也存在一定局限性：僅以甲型流感病毒為模型，未涉及RNA病毒（如新冠病毒、乙肝病毒）與DNA病毒（如HPV、EB病毒）的檢測驗證；后續可進一步拓展病毒種類，完善儀器在不同病毒載量測定中的性能數據。

博清生物科技（南京）有限公司研發的熒光定量PCR儀在病毒載量測定中表現出寬線性范圍、高靈敏度、高準確性與良好穩定性，其檢測性能與對照儀器高度一致，可滿足病毒學基礎研究、臨床診斷及治療監測中的病毒載量測定需求，具備廣闊的應用前景。